PCR

Co pouziva polymerázová reťazová reakcia

Na co sluzi polymerázová reťazová reakcia

Kto je autorom metódy PCR?

Zmnožená molekula DNA sa nazýva

Čo potrebujeme k PCR reakcii?

DNA môžeme izolovať

Najznámejšia a najpoužívanejšia Polymeraza

Štandardný reakčný tlmivý roztok obsahuje

Primery svojou polohou na templátovej DNA

Kde PCR reakcia prebieha?

Fazy PCR

Faktory ovplyvňujúce priebeh PCR

Co znizuje specifitu?

množstvo templátu, ktoré je možné úspešne amplifikovať za použitých podmienok

- schopnosť amplifikovať len úseky s presnou komplementaritou sekvencií v oblasti primerov

aké množstvo molekúl templátu sa kopíruje v jednom cykle. Teoreticky sa kopírujú všetky molekuly, prakticky je toto množstvo nižšie. 

miera presnosti sekvencie PCR produktu v porovnaní s templátom, t.j. do akej miery je výsledný PCR produkt (DNA fragment) sekvenčne identický s "originálom" - pôvodným templátom. 

reakcia využívajúca rekombinantný enzým Taq-polymerázy, ktorý na iniciáciu polymerizácie vyžaduje vysokú aktivačnú teplotu (napr. 95 °C, 5 min) pred záhajením 1. cyklu - bežná Taq-polymeráza má nízku aktivitu aj počas pipetovania mastermixu, kedy navyše funguje veľmi nepresne, hot-start polymeráza je naopak úplne neaktívna, takže jej použitie zvyšuje špecificitu a fidelitu PCR reakcie 

počiatočné cykly majú vysokú anelačnú teplotu, ktorá sa postupne v ďalších cykloch znižuje - vysoká teplota zabráni nešpecifickým väzbám primerov s templátovou DNA a neskoršia nižšia teplota namnoží už len špecifické PCR produkty

oddelenie rôznych molekúl DNA alebo RNA v spoločnej zmesi (roztoku) na základe veľkosti, zloženia a poradia báz. 

Je to zmes fragmentov DNA s presne definovanými veľkosťami (1000 bp , 1500 bp , 2000 bp...), ktoré počas elektroforetickej separácie vytvoria známy obraz, tzv . "rebrík"

Najčastejšie tlmivé roztoky, ktoré sa používajú v praxi

koncentrované roztoky, ktoré sa miešajú so vzorkou DNA (alebo RNA) pred nanášaním na gél.

Nanášacie tlmivé roztoky obsahujú farbivá

etídiumbromid