Лекція. Реплікація. Транскрипція.

                Трансляція.

Генетична система мітохондрій – кільцева ДНК, 37 генів

Ген - ділянка молекули ДНК, що несе цілісну інформацію про будову 1 молекули білка або РНК.

Маршал Ніренберг (1927-2010 р.) – в

1961 р. розшифрував генетичний код

Властивості генетичного коду:

1.         Триплетність  

2.         Універсальність

3.         Виродженість

      64 кодони (4³ комбінації нуклеотидів):

      61 – змістовні (кодують амінокислоти)

      АУГ – ініціюючий кодон (метіонін - еукар., формілметіонін – прокар.)       3 - УАА, УАГ, УГА - термінальні (нонсенс-кодони).

4.         Специфічність

5.         Односпрямованість ( 5'→3‘).

6.         Безперервність

7.         Код не перекривається

Таблиця генетичного коду

Реплікація  - процес подвоєння ДНК. Синтез дочірньої ДНК на матриці ДНК за принципом комплементарності.

Транскрипція - синтез РНК на матриці ДНК за принципом комплементарності.

Трансляція – біосинтез білка у рибосомах (матричний синтез білка). Синтез поліпептидного ланцюга у рибосомах відповідно генетичного коду мРНК.

Реплікація  - подвоєння ДНК

♥ Ядро, частково мітохондрії

♥ S-фаза клітинного циклу (підготовка до мітозу).

♥ Рівноцінний розподіл спадкової інформації під час мітозу.

Процес реплікації є

1.Матричним - синтез нових ланцюгів ДНК йде на ДНК-матриці (висока точність!)

2.Симетричним – матрицями одночасно слугують обидва ланцюги материнської ДНК

3.Напівконсервативним - молекула дочірньої ДНК складається з 1 материнського та 1 нового ланцюгів

4.Принцип комплементарності

5.Напрямок реплікації – 5′→ 3′ (!!!)

6.Реплікації піддається вся молекула ДНК.

Доказ напівконсервативного механізму реплікації - експеримент Мезельсона-Сталя (1957 р.)

₅′     Ì àòåðèí ñüêà ÄÍ Ê      ₃′

C G C C A T A

G C G G T A T

3′                                           5′

C C C A T A G C C A T

3′ C G G T A 5′

Äî ÷³ðí ³ ÄÍ Ê

5′ G C C A T _3′

C G G T A T C G G T A

Лідируючий ланцюг –безперервний, синтезується на матриці «3′→5′» Відстаючий ланцюг -  синтезується фрагментами на матриці ланцюга « 5′→3′» Субстрати та фактори реплікації

1.    ДНК-матриця

2.    Будівельний матеріал та джерела енергії – дАТФ, дГТФ, дЦТФ, ТТФ

3.    Праймер - РНК-затравка

4.    Субстрати для праймера – АТФ, ГТФ,  ЦТФ, УТФ.

5.    Ферменти

6.    ДНК-зв’язуючі білки (SSB-білки)

7.    Мg²⁺, Zn²⁺

Реплікативна вилка

Ферменти ініціації реплікації

Прокаріоти	Еукаріоти	Функція
ДНК-гіраза	Топоізомераза	Деспіралізує ДНК L розриває 5′- 3′ фосфодиефірні зв’язки і вносить негативні витки
Хеліказа	Хеліказа	Розплітає ДНК – розриває водневі зв’язки між азотистими основами за участі АТФ
Праймаза	ДНКполімераза α	Ініціює реплікацію: -                    розпізнавання точки реплікації -                    синтез праймера (8-10 рибонуклеотидів) -                    приєднання до праймеру ≈ 50 дезоксирибонуклеотидів

 

Прокаріоти	Еукаріоти	Функція
ДНКполімераза ІІІ	ДНКполімераза δ	Синтез лідируючого ланцюга (5′→3′) •   не починає синтез з “0” •   суперточність копіювання •   виправляє помилки: 3′→5′ екзонуклеазна активність •   АТФ-азна активність
	ДНКполімераза ε	Синтез відстаючого ланцюга (фрагменти Оказаки ≈1500 нукл.)
ДНКполімераза І	ДНКполімераза β	Видалення праймерів, заповнення пустот дезокрисиронуклеотидами

 

Прокаріоти	Еукаріоти	Функція
ДНКполімераза ІІ	ДНКполімераза ε, β	Репарація ДНК вирізають “помилки” – некомплементарні нуклеотиди
ДНК-лігаза	ДНК-лігаза	Зшивання фрагментів відстаючого ланцюга
-	ДНКполімераза γ	Реплікація  мітохондріальної ДНК

Етапи реплікації

1.    Ініціація – утворення реплікативної вилки  з напрямком руху 5′→3′

Деспіралізація, розплітання ДНК, синтез праймера

(стимулюють фактори росту)

«Точки ori» = оріджини (англ. оrigin – початок) = сайти початку реплікації ,

де формуються реплікативні вилки (100-1000)

Багатоцентрова реплікація  (від 100 до кількох тисяч точок) забезпечує подвоєння хромосом ссавців за 9 годин

2.    Елонгація – подовження ланцюгів ДНК в напрямку 5′→3′

    Лідируючий ланцюг:

•на матриці «3′→5′»

•1 праймер

•ДНК-полімераза δ

•безперервний

•рух - у напрямку вилки реплікації

   Відстаючий ланцюг :

•на матриці «5′→3′» •фрагменти Оказаки: = праймер + 1-2 тис дНМФ

•ДНК-полімерази α та ε

•рух - протилежно вилці

500- 5 000 пар нуклеотидів /хв

ДНК-полімераза β- видаляє праймери та заповнює пустоти дезоксирибонуклеотидами

3. Термінація –

L  зустріч 2-х вилок реплікації

L  зшивання відстаючого ланцюга

L  метилування ДНК

L  спіралізація та суперспіралізація ДНК

Інгібітори реплікації

1.Антибіотики

Афідиколін – інгібітор ДНКполімераз α, δ, ε

Доксорубіцин, мітоміцини, актиноміцин D – інтеркалятори

2. Фторхінолони – інгібітори ДНК-гірази прокаріот !!!

парами Г- Ц

Феномен недореплікації ДНК      3′

Видалення праймерів

5′

3′

Недореплікованість матричних ланцюгів з 3′-кінця

3′

Дочірні ланцюги є коротшими за материнські з 5′-кінця^{Гострі кінці}

“Гострі кінці” зрізають екзонуклеази – “вирівнюють” молекули ДНК

При кожній реплікації відбувається вкорочення хромосом ≈ на 50-60 нуклеотидів

Теломери

гексануклеотидні послідовності

[5′ ГГTTAГ 3′], що не містять генетичної інформації

Теломераза –

•в активному центрі є

РНК-матриця

•зворотна транскриптаза – синтез тДНК на матриці РНК

Теломеразна теорія

старіння: тривалість життя визначається швидкістю поділу соматичних клітин та довжиною теломер їх хромосом. 

Висока активність теломерази – в клітинах, що розмножуються:

епідерміс, ендометрій, лімфоцити, пухлини.

У нервових та м’язових клітинах – найменша довжина теломер,

Статеві клітини – “безсмертні”

Транскрипція – синтез РНК на матриці ДНК

♥ Ядро, проходить багаторазово, незалежно від клітинного циклу ♥ синтез всіх видів РНК мРНК (іРНК) – матриця для синтезу білка

тРНК, рРНК, мяРНК

Процес транскрипції є

1.Матричним -  РНК на ДНК-матриці

2.Асиметричним – матрицею слугує лише 1 ланцюг ДНК.

 Кодуючий (змістовний) ланцюг - той, з якого зчитується генетична інформація.

Некодуючий ланцюг -  матриця для РНК.

3.Принцип комплементарності – порядок включення рибонуклеотидів в РНК

4.Напрямок – 5′ → 3′

5.Відбувається у певних ділянках ДНК – транскриптонах.

Субстрати та фактори транскрипції

1. ДНК-матриця, АТФ, ГТФ,  ЦТФ, УТФ

2. ДНК-залежна РНК-полімераза

3.    Білкові фактори (ТАТА-фактор та ін.)

4.    мя РНК;  Mg²⁺, Zn²⁺.

Прокаріоти – єдина РНК-полімераза Еукаріоти – 3 види РНК-полімераз:

І – для пре-рРНК

ІІ - для пре-мРНК

ІІІ - для пре-тРНК

РНК-полімераза:

•        Cor-фермент (2α, β, β′) – полімераза

•        σ-фактор - ініціює транскрипцію, зв’язується з промотором.

Промотори – сайти ДНК (≈ 40 нуклеотидів), в яких РНК-полімераза зв’язується з ДНКматрицею. Містять сигнали початку транскрипції

 “-35-послідовність” -  зв’язує σ-фактор

“-10-послідовність” - бокс Прибнова (ТАТА-бокс)

Сигнали термінації транскрипції:

• паліндроми – нуклеотидні послідовності, що однаково читаються у прямому та зворотному напрямку • полі-АТ пари

напрямок транскрипції  

5′                                                                                           ДНК

	ТЦГГГЦГ		ЦГЦЦЦГА	ААААААА

3′

                       _{Літературні}                       «MAДAM»

паліндроми

«Madam, I am Adam»

Транскриптон (оперон) – ділянка між промотором і сайтом термінації

Етапи синтезу РНК

1. Ініціація транскрипції

Lσ-фактор зв’язується з промотором

LТАТА-фактор - з ТАТА-боксом і розплітає ДНК

LРНК-полімераза включає в ланцюг з 5′-кінця  перший (пуриновий) нуклеотид

Сильні промотори - 1 ініціація  за 1 сек Слабкі промотори -1 ініціація  за 10 хв.

Ініціація транскрипції та РНК полимераза  II

http://biology.kenyon.edu

2. Елонгація

L утворення  ДНК-РНК-гібриду (5′ → 3′)

швидкість ≈ 80 нуклеотидів за секунду, помилки – 1 на 10¹⁰

3. Термінація

Lтранскрипція паліндромів з утворенням

“шпильки”

L(+) фактори термінації (ρ-фактор)

L(-) пре-РНК

 

Процесінг – “дозрівання”  пре-РНК Посттранскрипційна модифікація пре-РНК

Процесінг пре- мРНК:

•          Сплайсинг – видалення інтронів, зшивання і екзонів

•          Кепування, поліаденілування

Гетерогенна ядерна РНК (пре-мРНК)

Екзон 1

Інтрон 1

Екзон 2

Інтрон 2

Екзон 3

Процесінг пре-тРНК та пре-рРНК : сплайсинг, метилування, хімічну модифікацію

Альтернативний сплайсинг

Інгібітори транскрипції

1.       α-Аманітин – інгібітор РНК-полімерази ІІ

2.       Рифампіцин, рифаміцин - інгібітор РНК-полімерази мікобактерій tbc

3. Актиноміцин Д

4. Вінкристин, вінбластин (алкалоїди) - інгібують процесінг пре-РНК Трансляція - біосинтез білка у рибосомах

Фактори

•          Рибосоми

•          20 α-L-амінокислот

•          тРНК (не менше 20) • мРНК (іРНК) - матриця • Ферменти:

•          Аміноацил-тРНК-синтетази (кодази)

•          Пептидилтрансфераза

•          Пептидилтранслоказа (фактор елонгации ЕF2)

•          Білкові фактори ініціації, елонгації, термінації

(рилізінг-фактори)

•          АТФ, ГТФ

•          Мg2+

Асоційований стан – активний

Полісоми – 5-6 рибосом, нанизаних на мРНК

Етапи синтезу білка

І. Активація амінокислот (проходить в цитоплазмі). Аміноациладенілат

Аміноацил-тРНК

ІІ. Власне трансляція (проходить в рибосомі).

    Етапи: ініціація, елонгація, термінація.

1.       Ініціація трансляції → утворення ініціюючого комплексу

2.       Елонгація – утворення пептидних зв’язків, ріст поліпептиду з  N-кінця, просування рибомоми по іРНК (5′ → 3′)

3.      

Термінація (стоп-кодони: УАА, УГА, УАГ)

Посттрансляційна  модифікація

1. Хімічна модифікація

(видалення ініціюючої АК – метіоніну

(метилування, карбоксилування, гідроксилування та ін.

(приєднання небілкових лігандів

(металів, кофакторів та ін.)

2. Частковий протеоліз

Фолдінг – утворення третинної структури білка

(згортання поліпептиду)

Молекулярні шаперони (chaperones) або білки теплового шоку (HSP) забезпечують фолдінг

Пріони - антишаперони

Фатальне сімейне безсоння

Хвороба Куру аборигенів Нової Гвинеї. "trembling with fear "

Хвороба

Кройтцфельдта-Якоба

«коров’ячий сказ»

(губчаста енцефалопатія)

Інгібітори трансляції:

1.    Антибіотики

Зв’язують  50S Інгібітори елонгації - блокують пептидилтрансферазну реакцію і транслокацію.	макроліди (еритроміцин, азітроміцин); левоміцетин, лінкоміцин.
Зв’язують 30S Інгібітори ініціації трансляції	тетрацикліни, аміноглікозиди (стрептоміцин, гентаміцин).

2.    Інтерферони – інгібітори ініціації трансляції:

• фосфорилування еIF-2 → противірусна та протипухлинна дія

3.   
Дифтерійний токсин – інгібітор елонгації

• АДФ-рибозилування фактору елонгації

→ інгібування транслокації

НАД + еЕF-2 → еЕF-2-АДФ-рибоза + Нікотинамід

Нематричний синтез поліпептидів (без мРНК та рибосом)

1.Синтез з АК за участі мультиферментних комплексів: глутатіон, рилізінг-фактори гіпоталамусу.

2.Нарізання білків-попередників на окремі пептиди за участі протеаз:

•        синтез ендорфінів

•        синтез кінінів (брадикінін)