Презентація "ДНК-аналітичні технології. ДНК-матриці. ПЛР."

ДНК-аналітичні технології. ДНК-матриці. ПЛР. Підготувала. Галій Софія Миколаївна2020 р.

ДНК –аналітичні технології. ДНК - матриця. Сучасні біологічні ДНК-матриці є високочутливим і точним аналітичним інструментом отриманні і обробки великої кількості інформації з тією перевагою, що одночасно і швидко аналізується велика кількість зразків різного біологічного матеріалу. Завдяки цим особливостям технологія ДНК-матриць все частіше застосовується у фундаментальних і прикладних дослідженнях, а також може бути використана в діагностичних цілях. Застосування ДНК-матриць в наукових дослідженнях різних аспектів біології клітин дозволяють проводити моніторинг експресії всіх генів одночасно. Такий метод забезпечує більш цілісний підхід до вивчення клітинної фізіології, тим самим доповнюючи традиційний “gene-by-gene”.

ДНК-матриці являють собою упорядковану систему фрагментів нуклеїнових кислот, які відповідають певним генам і знаходяться в певному положенні на матриці, якою може служити нейлонова мембрана, скляна підкладка або силікон. ДНК мікроматриць містить десятки тисяч елементів розміром = 100мкм в діаметрі, на скляній поверхні площею в кілька квадратних сантиметрів. Одним із таких методів є технологія ДНК-матриць, в основі якої лежить принцип специфічної гібридизації фрагментів ДНК. Суть методу ДНК-матриць полягає в паралельній гібридизації суміші мічених нуклеїнових кислот (мішеней) з тисячами специфічних фрагментів нуклеїнових кислот (зондами), що ідентифікуються положенням в окремих осередках на матриці.

На даний час використовують 3 типи ДНК-матриць. Перший тип-це ДНК-матриці, в яких зразки синтезуються in situ, тобто безпосередньо на поверхні чіпа. У двох інших типах матриць зразки синтезуються незалежно і потім, наносяться на хімічно модифіковані скляні поверхні чіпів. Природа зразків, дозволяє їх класифікувати як дволанцюгові ДНК-матриці (II тип) і олігонуклеотидні ДНК-матриці (III тип).

Найбільш відомими ДНК-матрицями у виготовлені яких використовується in situ – технологія є матриці Gene Chip, що випускаються компанією Affymetrix. Для виготовлення матриць Gene Chip використовують комбінацію унікального методу фотолітографії і методів комбінаторної хімії. У 2005 р в журналі Science групою дослідників з компанії Perlegen були опубліковані результати генотипування 1586383 поліморфізмів одиничного нуклеотиду (SNP) серед американців, африканців і азіатів. В даний час компаніями Solexa і Helicos Biosciences зроблені спроби створення технологій на основі ДНК-матриць для визначення нуклеотидної послідовності генома людини.

ПЛР використовується в багатьох галузях для проведення аналізів і в наукових експериментах. Полімеразна ланцюгова реакція нині є найбільш досконалим діагностичним методом молекулярної біології, молекулярної генетики і клінічної лабораторної діагностики, що дозволяє виявляти в тканинах і біологічних рідинах організму поодинокі клітини збудників багатьох інфекційних захворювань, виявляти і ідентифікувати навіть однонуклеотидні зміни в структурі генів. Значення Полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)Для незалежного синтезу ДНК-зондів, серед яких виділяють дволанцюгові фрагменти ДНК і олігонуклеотиди, використовують різні методи. Один із них полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

ПЛР використовують для порівняння так званих "генетичних відбитків пальців". Необхідно зразок генетичного матеріалу з місця злочину (події) – кров, слина, сперма, волосся і т. ін. Його порівнюють з генетичним матеріалом підозрюваного. Достатньо зовсім малої кількості ДНК, теоретично – однієї копії. Криміналістика. ДНК розщеплюють на фрагменти, потім ампліфікують за допомогою ПЛР. Фрагменти розділяють за допомогою електрофорезу ДНК. Отриману картину того, що має в розпорядженні смуг ДНК і називають генетичним відбитком пальців (англ. genetic fingerprint).

Хоча "генетичні відбитки пальців" унікальні (за винятком випадку однояйцевих (конкордантних) близнюків), родинні зв'язки все ж можна встановити, зробивши декілька таких відбитків. Встановлення батьківства Той же метод можна застосувати, злегка модифікувавши його, для встановлення еволюційної спорідненості серед організмів.

ПЛР дає можливість істотно прискорити і полегшити діагностику спадкових і вірусних захворювань. Певний ген ампліфікують за допомогою ПЛР з використанням відповідних праймерів, а потім секвенують для визначення мутацій. Медична діагностика. Вірусні інфекції можна виявлятивідразу після ураження, за тижні або місяці до того, як проявляться симптоми захворювання

Іноді ліки виявляються токсичними або алергенними для деяких пацієнтів. Причини цього – частково в індивідуальних відмінностях у сприйнятті і метаболізмі ліків та їх похідних. Ці відмінності детермінуються на генетичному рівні. Наприклад, у одного пацієнта певний цитохром (білок печінки, що відповідає за метаболізм сторонніх речовин) може бути активніший, у іншого – менш. Медицина, що персоналізується. Для того, щоб визначити, який різновид цитохрому має цей пацієнт, запропоновано проводити ПЛР-аналіз перед застосуванням ліків. Такий аналіз називають попередніми генотипуванням (англ. prospective genotyping).

Це процес виділення генів і, в результаті генно-інженерних маніпуляцій, отримання великої кількості продукту цього гена. ПЛР використовується для того, щоб ампліфікувати ген, який потім вставляється у вектор – фрагмент ДНК, що переносить сторонній ген у той же самий або інший, зручний для вирощування, організм. Клонування генів. Як векторів використовують, наприклад, плазміди або вірусну ДНК. Вставку генів у сторонній організм зазвичай використовують для отримання продукту цього гена – РНК або, найчастіше, білка. Таким чином у промислових кількостях отримують багато білків для використання в сільському господарстві, медицині та ін.

У методі секвенування з використанням мічених флуоресцентною міткою або радіоактивним ізотопом ПЛР є невід'ємною частиною, оскільки саме в ході полімеризації в ланцюг ДНК вбудовуються похідні нуклеотидів, мічені флуоресцентною або радіоактивною міткою. Секвенування ДНКЦе зупиняє реакцію, дозволяючи визначити положення специфічних нуклеотидів після розподілу синтезованих ланцюжків у гелі.

Нині ПЛР стала основним методом проведення мутагенезу (внесення змін до нуклеотидної послідовності ДНК). Використання ПЛР дозволило спростити і прискорити процедуру проведення мутагенезу, а також зробити її надійнішою і відтворною. Мутагенез

Особливо ефективний метод ПЛР для діагностики важко-культивованих, некультивованих форм мікроорганізмів, з якими часто доводиться стикатися при латентних і хронічних інфекціях, оскільки цей метод дозволяє уникнути складнощів, пов'язаних з вирощуванням таких мікроорганізмів у лабораторних умовах. Застосування ПЛР-діагностики також украй ефективно відносно збудників з високою антигенною мінливістю і внутрішньоклітинних паразитів. Методом ПЛР можливе виявлення збудників не лише в клінічному матеріалі, отриманому від хворого, але і в матеріалі, що отримується з об'єктів зовнішнього середовища (вода, грунт), і в продуктах харчування. Ефективність методу ПЛР

Дякую за увагу!