Метод полімеразної ланцюгової реакції

Метод полімеразної ланцюгової реакції в ідентифікації вірусів.

Одним з важливих завдань, що стоять перед сучасною вірусологічною наукою, є своєчасне виявлення та ідентифікація вірусів – збудників інфекційних захворювань. Останнім часом усе більшого розповсюдження набувають найновіші методи діагностики, які базуються на виявленні в досліджуваних клінічних та рослинних зразках специфічних послідовностей вірусного генома. Найбільшого поширення набула полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) (PCR- polymerasechainreaction).

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - експериментальний метод молекулярної біології, спосіб значного збільшення малих концентрацій певних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) у біологічному матеріалі (пробі). В основі методу ПЛР лежить багаторазове подвоєння певної ділянки ДНК за допомогою ферментів у штучних умовах (in vitro). В результаті напрацьовується кількість ДНК, достатня для візуальної детекції. При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і тільки в тому випадку, якщо вона присутня в досліджуваному зразку.

Більш ніж за 30 років, які минули з часу відкриття ПЛР (1983 рік, Кері Мюлліс, Cetus, California) ПЛР набула застосування у всіх галузях біології, опубліковано тисячі робіт, у яких використовувалася ця реакція. ПЛР значно полегшила роботу молекулярних біологів, вірусологів – з її допомогою можливе отримання якої завгодно кількості фрагментів специфічної ДНК.

Зараз жодне молекулярно-біологічне дослідження генів, в тому числі і вірусних, не обходиться без її застосування. Завдяки ПЛР стало можливим досліджувати віруси, вбудовані в геном клітини-господаря, а також віроїди та вірусоїди. ПЛР дає можливість протягом дня з одієї молекули ДНК отримати 100 млрд. подібних за структурою молекул.

Ця реакція дуже проста у виконанні, необхідні лише пробірка, декілька відносно простих реагентів, джерело тепла та охолодження. Препарат ДНК, який необхідно копіювати, може бути очищеним, а може становити складну суміш біологічних речовин. Як джерело ДНК підходить і біоптат з тканини пацієнта, і тотальна НК з рослин, і одна волосина, і крапля крові. Для проведення ПЛР необхідні такі складові частини: • послідовність ДНК, що досліджується; • буфер; • дезоксирибонуклеозидтрифосфати (d. NTP); • два праймери, специфічних для зв’язування з дослідним зразком; • Tag-полімераза

Для розуміння механізмів ПЛР необхідно відзначити властивість ДНК, яка є основою ПЛР, – це можливість ДНК денатуруватися (при плавленні) та ренатуруватися (при відпалюванні). Тобто, при нагріванні дволанцюгові молекули ДНК розплітаються та утворюють 2 окремі ланцюги, а при охолодженні відбувається їхня ренатурація – знову з’єднуються 2 ланцюги за принципом комплементарності. Крім простого збільшення кількості копій ДНК (цей процес називається ампліфікацією), ПЛР дозволяє проводити безліч інших маніпуляцій з генетичним матеріалом (введення мутацій, зрощення фрагментів ДНК), і широко використовується в біологічній та медичній практиці, наприклад, для діагностики захворювань (спадкових, інфекційних) для встановлення батьківства, для клонування генів, введення мутацій, виділення нових генів.

Метод ПЛР дозволяє визначити наявність збудника захворювання, навіть якщо в пробі є лише кілька молекул ДНК збудника. ПЛР дозволяє діагностувати наявність збудників, що довго ростуть, не вдаючись до трудомістких мікробіологічних методів, що особливо актуально в гінекології та урології при діагностиці урогенітальних інфекцій, що передаються статевим шляхом (ІПСШ). Також цим методом проводять діагностику вірусних інфекцій, таких як гепатити, ВІЛ, коронавірус COVID-19 та ін.

Використані джерела: Вірусологія. Навчальний посібник для лабораторних занять / В. П. Поліщук, І. Г. Будзанівська, Т. П. Шевченко, О. М. Андрійчук, Т. А. Компанець, О. А. Кондратюк, Г. В. Коротєєва, О. В. Молчанець, А. В. Харіна, О. В. Шевченко. – К.: ЦП «Компринт», 2017. – 242 с. Вірусологія: підручник / С. М. Шамрай, Д. В. Леонтьєв. – Х.: Харківський національний педагогічний університет імені Г. С. Сковороди, 2019. – 244 с. https://www.invitro.ru/library/labdiagnostika/16110/