Збереження та реалізація спадкової інформації

ПІДГОТОВКА ДО НМТ 2024 БІОЛОГІЯЗбереження та реалізація спадкової інформації

Гени. Геном. Усім організмам притаманна спадковість — здатність передавати свої ознаки та особливості індивідуального розвитку нащадкам. Одиниця спадковості — ген. Ген — це ділянка молекули ДНК, що містить інформацію про первинну структуру молекули білка або РНК і визначає можливість розвитку ознаки. Ген кодує спадкову інформацію про структуру певного білка, нуклеїнової кислоти або виконує регуляторні функції. Будь-який ген є ділянкою молекули ДНК. Ген відповідає за утворення однієї або декількох ознак організму. Проте, більшість ознак утворюються у результаті взаємодії кількох генів.

у 1865 р. Грегор Мендель довів існування спадкових «задатків»;термін «ген» було запропоновано у 1909 році датським ученим Вільгельмом Людвігом Йогансеном;у першій половині ХХ століття Томас Морган установив, що гени лінійно розташовані у хромосомах ядра;у 1953 р. Джеймс Уотсон і Френсіс Крік відкрили просторову структуру ДНК. За функціональним значенням розрізняють структурні гени (містять 100, 1000 і більше нуклеотидів) кодують структуру білків і РНК; і регуляторні (містять декілька десятків пар нуклеотидів) контролюють діяльність структурних генів — забезпечують активацію або гальмування зчитування інформації. Регуляторні гени:слугують місцем приєднання ферментів та інших біологічно активних речовин;впливають на активність структурних генів;беруть участь у процесах реплікації ДНК і транскрипції.Історія вивчення гена:

Геном — сукупність спадкового матеріалу у клітинах організму певного виду. Термін «геном» був запропонований Гансом Вінклером у 1920 році для опису сукупності генів. Основні положення сучасної теорії гена:1) кожен ген займає певне положення у хромосомі — локус.2) Ген — частина молекули ДНК, яка має певну послідовність нуклеотидів і є функціональною одиницею спадкової інформації. Кількість нуклеотидів, які входять до складу різних генів є різною. Гени розташовані у хромосомі по її довжині у лінійному порядку: один за одним. При цьому вони не перекриваються.3) Всередині гена можуть відбуватися рекомбінації (перерозподіл генетичного матеріалу) і мутації (зміни генетичного матеріалу).4) Існують структурні гени — які кодують синтез білків і регуляторні — які контролюють і спрямовують діяльність структурних генів.5) Ген не бере безпосередньої участі в синтезі білка, він є матрицею для утворення посередників — різних молекул РНК, які безпосередньо беруть участь у синтезі.6) Розташування триплетів із нуклеотидів у структурних генах є відповідним (колінеарним) до амінокислот у поліпептидному ланцюгу, який кодується даним геном.7) Молекули ДНК здатні до репарації (виправлення ушкоджень ДНК), тому не всі пошкодження гена призводять до мутації.8) Генотип складається з окремих генів, але функціонує як єдине ціле. На функцію генів впливають чинники як внутрішнього, так і зовнішнього середовища

Функції генів визначаються такими властивостями:специфічність — ген містить спадкову інформацію лише про певний продукт або регулює синтез лише одного конкретного білка;стабільність — гени здатні зберігати властивий їм порядок розташування нуклеотидів;лабільність — гени здатні до змін і можуть мутувати;взаємодія генів — гени здатні впливати один на одного за участю білків, що є продуктами реалізації закодованої у них спадкової інформації;множинна дія генів — один ген може впливати на розвиток декількох ознак;полімерна дія генів — декілька генів можуть впливати на формування однієї ознаки

Гени прокаріотів. Гени прокаріотичних клітин мають відносно просту структуру. Найчастіше кожен із цих генів містить інформацію тільки про одну структуру — молекулу білка або РНК. У прокаріотів генетичний матеріал має оперонну організацію. Концепцію оперона запропонували у 1961 році французьки вчені Франсуа Жакоб і Жак Моно, за що у 1965 році отримали Нобелівську премію. Оперон — функціональна одиниця організації геному прокаріотів. Оперон — структура, яка складається з кількох структурних генів. Він дозволяє прокаріотам за один раз відразу синтезувати продукти кількох генів. Структурні гени в опероні розташовані поряд і мають на всіх один спільний промотор, один спільний термінатор і один спільний оператор, який регулює його роботу.

Спадкова інформація прокаріотичних клітин міститься не лише у нуклеоїді але і у плазмідах — невеликих молекулах ДНК у цитоплазмі.

Будова генів еукаріотів. На відміну від генів прокаріотів, гени еукаріотичних клітин не утворюють оперонів. Гени еукаріотів мають мозаїчну будову:на початку гена містяться нуклеотиди, які називаються промотором — з ними зв'язуються білки, які зчитують інформацію;регуляторна ділянка може прискорювати або сповільнювати синтез продукту гена;основною частиною гена є кодувальна, вона містить ділянки генів, які кодують спадкову інформацію — екзони, і ділянки, які її не кодують — інтрони;завершальна ділянка гена називається термінатором.

Спадкова інформація клітин міститься не лише в ядрі (у еукаріотів) та нуклеоїді (у прокаріотів), але й у інших структурах цитоплазми:у еукаріотичних клітин — це мітохондрії та хлоропласти;у прокаріотичних клітин — плазміди (невеликі молекули ДНК у цитоплазмі).

Як відомо, білки складаються з амінокислот, а ДНК — з нуклеотидів. У кожному з білків амінокислоти розташовані в певній послідовності. Послідовність нуклеотидів ДНК визначає послідовність амінокислот у молекулі білка, що й зумовлює особливості кожного з них. У кожному гені послідовність нуклеотидів різна. Тому різні гени містять інформацію про будову різних молекул білка. Деякі гени містять інформацію не про молекулу білка, а про молекулу РНК, яка виконує в клітині якусь окрему функцію. Молекули білка або РНК, будова яких визначається послідовністю нуклеотидів гена, називають продуктом гена. Будь-який ген є ділянкою молекули ДНК, який відповідає за утворення однієї або декількох ознак організму. Для утворення продукту гена на відповідній ділянці ДНК ферменти спочатку синтезують відповідну їй за будовою молекулу РНК. У подальшому ця молекула може використовуватися в різних процесах у клітині. Або за інформацією з цієї РНК може синтезуватися молекула білка, яка і є продуктом гена:ген (ділянка ДНК) — молекула РНК — молекула білка — ознака;ген (ділянка ДНК) — молекула РНК — ознака.

Генетичний код. Генетичний код — це система запису генетичної інформації про послідовність розташування амінокислот у білках у вигляді послідовності нуклеотидів у ДНК або РНК. Кожній амінокислоті білка відповідає послідовність з трьох розташованих один за одним нуклеотидів ДНК — триплет. Кожен триплет нуклеотидів кодує певну амінокислоту, яка буде вбудована у поліпептидний ланцюг. Як відомо, до складу ДНК можуть входити чотири нітрогеновмісних основи: аденін (А), гуанін (Г), тимін (Т) і цитозин (Ц). Число сполучень з 4 по 3 складає 43=64, тобто ДНК може кодувати 64 амінокислоти. Проте кодується тільки 20 амінокислот. Виявилося, що багатьом амінокислотам відповідає не один, а декілька кодонів. Передбачається, що така властивість генетичного коду (виродженність) підвищує надійність зберігання і передачі генетичної інформації під час ділення клітин.

Приклад:амінокислоті аланіну відповідає 4 триплета — ЦДА, ЦГГ, ЦГТ і ЦГЦ. Звідси випливає, що випадкова помилка у третьому нуклеотиді кодону не зможе привести до змін у структурі білка — у будь-якому випадку це буде кодон аланіну. На даний час складена карта генетичного коду, тобто відомо, які триплети у ДНК відповідають тій чи іншій з 20 амінокислот, що входять до складу білків.

Правила користування таблицею: Перший нуклеотид у триплеті береться з лівого вертикального рядка, другий — з верхнього горизонтального рядка, а третій — з правого вертикального. Там, де будуть перетинатися лінії, що ідуть від усіх трьох нуклеотидів, і буде назва потрібної амінокислоти. Оскільки у молекулі ДНК містяться сотні генів, то до її складу обов'язково входять триплети — стоп-кодони, які є «знаками пунктуації» і позначають початок або кінець того чи іншого гена.

Властивості генетичного коду:1. Код складається з триплетів. Одна амінокислота кодується трьома нуклеотидами.2. Код є універсальним. Усі живі організми (від бактерії до людини) використовують єдиний генетичний код.3. Код є виродженим. Одна амінокислота кодується більш, ніж одним кодоном.4. Код є однозначним. Кожен триплет відповідає тільки одній амінокислоті.5. Код не перекривається. Один нуклеотид не може входити до складу декількох кодонів у ланцюгу РНК. Послідовність нуклеотидів у молекулі ДНК визначає її специфічність, а також специфічність білків організму, які кодуються цією послідовністю. Ці послідовності індивідуальні і для кожного виду організмів, і для окремих особин виду. Зверни увагу!Довжина одного нуклеотиду становить 0,34 нм. Середня молекулярна маса одного нуклеотиду дорівнює 345 а.о.м.

Будова та основні типи РНКМолекули РНК містяться в ядрі, цитоплазмі, рибосомах, мітохондріях та пластидах клітини. Будова РНКРибонуклеїнова кислота (РНК) — лінійний полімер, що має один ланцюжок нуклеотидів. Мономери (нуклеотиди) РНК складаються з п'ятикарбонового моносахариду — рибози, залишку ортофосфатної кислоти і нітрогеновмісної основи.

Три нітрогеновмісних основи у молекулах РНК такі самі, як і у ДНК — аденін, гуанін, цитозин, а четвертим є урацил. Утворення полімеру РНК відбувається (також само, як і у ДНК) завдяки ковалентним зв'язкам між рибозою і залишком ортофосфатної кислоти сусідніх нуклеотидів.

Зверни увагу!Довжина одного нуклеотиду становить 0,34 нм. Середня молекулярна маса одного нуклеотиду дорівнює 345 а.о.м. Типи РНКІнформаційні, або матричні, РНК (іРНК) складають близько 5 % усієї клітинної РНК. Вони синтезуються в ядрі (на ділянці одного з ланцюгів молекули ДНК) за участю ферменту РНК-полімерази. Основна функція іРНК — зняття інформації з ДНК і перенесення її до місця синтезу білка — на рибосоми.

Рибосомні (рибосомальні) РНК (р. РНК) — синтезуються у ядерці, входять до складу рибосом. Вони беруть участь у формуванні активного центру рибосоми, де відбувається процес біосинтезу білка. р. РНК складають приблизно 85 % усіх РНК клітини. р. РНК разом з білками забезпечують певне розташування іРНК і т. РНК під час синтезу білкової молекули. Транспортні РНК (т. РНК) — утворюються в ядрі на ДНК, потім переходять у цитоплазму. Вони складають близько 10 - 15 % клітинної РНК і є невеликими за розміром (складаються з 70 - 90 нуклеотидів). Основна функція т. РНК є транспортування амінокислоти до місця синтезу білка на рибосомі. Для перенесення кожного виду амінокислот до рибосоми потрібен окремий вид т. РНК. Будова усіх т. РНК є подібною. Їх молекули утворюють своєрідні структури, що нагадують за формою лист конюшини. Типи РНК розрізняються за триплетами нуклеотидів, розташованому «на верхівці». Цей триплет (антикодон) за генетичним кодом є комплементарним кодону іРНК, що кодує відповідну амінокислоту. Амінокислота прикріплюється спеціальним ферментом до «черешка листа» і транспортується в активний центр рибосоми.

Кожен тип т. РНК є високо специфічним, тобто переносить тільки конкретну амінокислоту. Таким чином, різні типи РНК являють собою єдину функціональну систему, спрямовану на реалізацію спадкової інформації через синтез білка. Малі ядерні РНК (мя. РНК) — беруть участь у процесах дозрівання РНК та регуляції процесів транскрипції.

Етапи реалізації спадкової інформаціїСпадкова інформація, яка зберігається в ДНК, використовується клітиною у вигляді синтезованих продуктів (молекул РНК і білків). Реалізація цієї інформації відбувається в кілька етапів — транскрипція, дозрівання РНК і трансляція. Основні етапи реалізації спадкової інформації:транскрипція — відбувається у прокаріотів — у цитоплазмі, в еукаріотів — у ядрі, мітохондріях і пластидах. Синтез ланцюга іРНК відбувається за зразком одного з ланцюгів ДНК на основі принципу комплементарності;дозрівання РНК (процесинг) — відбувається в ядрі еукаріотичних клітин — з молекули іРНК видаляютья інтрони, а екзони сполучаються в одну молекулу іРНК;трансляція — у прокаріотів відбувається у цитоплазмі, в еукаріотів — у цитоплазмі, на гранулярній ендоплазматичній сітці, в мітохондріях і пластидах. Відбувається синтез молекул білка на рибосомі згідно з інформацією молекули РНК

За відкриття механізму синтезу РНК іспанський біохімік С. Очоа разом з Корнбергом у 1959 році отримали Нобелівську премію з фізіології та медицини. Зазвичай, процес транскрипції генів поділяється на 3 стадії:на початковій стадії транскрипції відбувається розплітання ДНК і зв'язування РНК-полімерази з промоторною послідовністю гена, що є сигналом для початку транскрипції;наступною є стадія, під час якої нарощується ланцюг РНК, тобто відбувається послідовне приєднання рибонуклеотидів на основі принципу комплементарності;кінцевою стадією транскипції є стадія завершення зчитування інформації з ДНК на РНК при досягнені термінаторної послідовності гена. Результатом є утворення первинної РНК (про. РНК). Після транскрипції в еукаріотичних клітинах відбувається дозрівання про. РНК (процесинг). У результаті процесингу про. РНК перетворюється на зрілу інформаційну РНК (іРНК), яка експортується з ядра до цитоплазми

У клітинах регуляція реалізації генетичної інформації може відбуватися за допомогою декількох механізмів:перший механізм — взаємодія продуктів регуляторних генів (зазвичай білків) з певними структурами генів: оператором, промотором або регуляторними ділянками. Це дозволяє змінювати швидкість роботи генів.другий механізм — модифікація деяких нуклеотидів у ланцюжках ДНК. Якщо до них приєднується метильний радикал (−CH3), то зчитування інформації з ділянки ДНК за таким нуклеотидом стає неможливим.третій механізм — пакування певних ділянок ДНК за допомогою білків таким чином, щоб з них не можна було зчитати спадкову інформацію

Способи поділу клітин. Поділ клітин забезпечує у живій природі найважливіші процеси:1) розмноження одноклітинних організмів;2) ріст і розвиток багатоклітинних організмів;3) постійне оновлення тканин та органів;4) відновлення тканин та органів після пошкоджень. Відомі чотири основні способи поділу клітин: прямий бінарний поділ, амітоз, мітоз, мейоз. Прямий бінарний поділ характерний для прокаріотів (бактерій та ціанобактерій). У бактеріальній клітині міститься одна кільцева молекула ДНК. Перед поділом клітини ДНК подвоюється. Однакові молекули ДНК, що утворилися, прикріплюються до цитоплазматичної мембрани (ЦПМ). Під час поділу ЦПМ вростає між двома молекулами ДНК і ділить клітину навпіл. У кожній дочірній клітині виявляється по одній ідентичній молекулі ДНК. Прямий бінарний поділ

Амітоз, або прямий поділ — ділення ядра шляхом перетяжки, що відбувається без спіралізації хромосом. Амітозний поділ зустрічається:у високоспеціалізованих клітинах з низькою активністю (клітинах хрящів, рогівки ока, печінки, ендоспермі насіння, стінок зав'язі маточки), у дегенерованих, приречених на загибель клітин рослин та тварин. При амітозі часто спостерігається лише поділ ядра, без поділу цитоплазми. У результаті можуть утворитися багатоядерні клітини. Якщо ж цитоплазма ділиться, то розподіл клітинних компонентів, як і ДНК, відбувається довільно. Амітоз — найекономніший спосіб поділу, що відбувається з мінімальними енергетичними витратами. Мітоз — непрямий поділ соматичних клітин еукаріотів, у результаті якого хромосомний набір передається без змін. Мітоз лежить в основі росту організмів, регенерації пошкоджених частин, вегетативного розмноження. Мейоз — поділ клітин еукаріотів, що веде до утворення гаплоїдних клітин, тобто зменшення хромосомного набору вдвічі. Мейоз призводить до утворення гамет у тварин та спор у рослин. При цьому з однієї вихідної клітини з диплоїдним набором хромосом утворюються чотири клітини з гаплоїдними різними хромосомними наборами.

Інтерфаза. Клітинний (життєвий) цикл — це період існування клітини з моменту утворення до її загибелі або поділу. У різних видів організмів клітинний цикл займає різний час: у прокаріотів він триває 20 — 30 хвилин, а в клітинах еукаріотів може тривати від 10 до 20 годин. У молодих організмах клітини діляться часто, потім поступово час між поділами збільшується. Деякі клітини взагалі втрачають здатність до поділу (нейрони, клітини серцевого м'яза). Клітинний цикл складається з інтерфази та поділу. Клітинний цикл

Інтерфаза — період життєдіяльності клітини між двома поділами (мітозами). Під час інтерфази клітина виконує свої функції та готується до поділу. Головний процес, що відбувається при цьому — подвоєння ДНК (реплікація). Молекула ДНК розкручується за допомогою спеціального ферменту на дві нитки. Фермент розриває водневі зв'язки між комплементарними нітроген умісними основами. Нитки ДНК розходяться. До кожного нуклеотиду ниток ДНК, що роз'єдналися, фермент ДНК-полімераза підлаштовує комплементарний нуклеотид. Реплікація ДНК

Добудовані нуклеотиди з'єднуються один з одним. У результаті утворюються дві подвійні молекули ДНК, кожна з яких є точною копією вихідної ДНК. У інтерфазі відбувається також накопичення АТФ, збільшення кількості органоїдів, синтез речовин, які є необхідними для утворення веретена поділу. Мітоз. Мітоз — непрямий поділ соматичних клітин еукаріотичних організмів, при якому відбувається утворення двох дочірніх клітин, хромосомні набори яких такі самі, як у материнській клітині. Підготовка клітини до мітозу відбувається в інтерфазі: подвоюється ДНК, накопичується АТФ, синтезуються білки веретена поділу, подвоюються центріолі. Мітоз включає у себе два процеси: каріокінез (поділ ядра) і цитокінез (поділ цитоплазми). Виділяють чотири фази мітозу: профазу, метафазу, анафазу і телофазу.

Зверни увагу!У схемах поділу гаплоїдний набір хромосом позначають літерою n, а молекул ДНК (тобто хроматид) — літерою с. Перед літерами вказують кількість гаплоїдних наборів:1n2с — гаплоїдний набір подвоєних хромосом,2n2с — диплоїдний набір поодиноких хромосом,2n4с — диплоїдний набір подвоєних хромосом. Приклад:у клітинах людини гаплоїдний набір становлять 23 хромосоми. Отже, запис 2n2с означає 46 хромосом і 46 хроматид, а 2n4с — 46 хромосом і 92 хроматиди, тощо. Фази мітозу

Профаза. У ядрі молекули ДНК коротшають і скручуються (спіралізуються), утворюючи компактні хромосоми. Кожна хромосома складається з двох молекул ДНК (двох хроматид), з'єднаних центромерою. Ядерна оболонка розпадається. Хромосоми невпорядковано розташовуються у цитоплазмі. Розчиняються ядерця. Починає формуватися веретено поділу, частина ниток якого прикріплюється до центромерів хромосом. У тваринній клітині починають розходитися центріолі. Профаза мітозу

Метафаза. Хромосоми розташовуються на екваторі клітини, утворюючи метафазну пластинку. Хроматиди з'єднані у сфері первинної перетяжки з нитками веретена поділу. Центріолі розташовуються біля полюсів клітини. Метафаза мітозу

Анафаза. Кожна хромосома, що складається із двох хроматид, поділяється на дві ідентичні дочірні хромосоми. Дочірні хромосоми розтягуються нитками веретена поділу до полюсів клітини. У кожного полюса виявляється однаковий генетичний матеріал. Анафаза мітозу

Телофаза. Хромосоми розкручуються. Навколо хромосом починають формуватися ядерні оболонки. У ядрах з'являються ядерця. Нитки веретена поділу руйнуються. Телофаза мітозу. У цьому каріокінез завершується. Відбувається цитокінез — поділ цитоплазми. Цитокінез тваринної клітини. Мітоз у рослин

Мейоз. Мейоз — це спосіб поділу клітин, в результаті якого з однієї вихідної клітини з диплоїдним хромосомним набором утворюються чотири клітини з різними наборами гаплоїдних хромосом. Підготовка клітини до мейозу відбувається в інтерфазі: подвоюється ДНК, накопичується АТФ, синтезуються білки веретена поділу. Мейоз включає два наступних один за одним поділи клітини. Перший поділ мейозу (мейоз I) призводить до зменшення хромосомного набору і називається редукційним. Воно включає чотири фази. Перший поділ мейозу

Профаза IВідбувається скручування молекул ДНК та утворення хромосом. Кожна хромосома складається із двох гомологічних хроматид — 2n4c. Гомологічні (парні) хромосоми зближуються і скручуються, тобто відбувається кон'югація хромосом. Потім гомологічні хромосоми починають розходитися. При цьому утворюються перехрести і відбувається кросинговер — обмін ділянками між гомологічними хромосомами. Розчиняється ядерна оболонка. Руйнуються ядерця. Формується веретено поділу. Кон'югація хромосом та кросинговер

Метафаза IСпіралізація хромосом досягає максимуму. Пари гомологічних хромосом (чотири хроматиди) вишиковуються на екваторі клітини. Утворюється метафазна пластинка. Кожна хромосома з'єднана з нитками веретена поділу. Хромосомний набір клітини — 2n4c. Анафаза IГомологічні хромосоми, які складаються з двох хроматид, відходять друг від друга. Нитки веретена поділу розтягують хромосоми до полюсів клітини. З кожної пари гомологічних хромосом до полюсів потрапляє лише одна. Відбувається редукція — зменшення кількості хромосом удвічі. У полюсів клітини виявляються гаплоїдні набори хромосом, які складаються з двох хроматид. Хромосомний набір у кінці анафази: у полюсів — 1n2c, у клітині — 2n4c. Телофаза IВідбувається формування ядер. Ділиться цитоплазма. Утворюються дві клітини із гаплоїдним набором хромосом. Кожна хромосома представлена ​​двома хроматидами. Хромосомний набір кожної з клітин, що утворилися — 1n2c.

Через короткий проміжок часу починається друге ділення мейозу. У цей час не відбувається подвоєння ДНК. Діляться дві гаплоїдні клітини, що утворилися внаслідок першого поділу. Другий поділ мейозу Профаза IIЯдерні оболонки руйнуються. Хромосоми безладно розташовуються в цитоплазмі. Формується веретено поділу. Хромосомний набір клітини — 1n2c. Метафаза IIХромосоми розташовуються у площині екватору. Кожна хромосома складається із двох хроматид. До кожної хроматиди прикріплено нитки веретена поділу. Хромосомний набір клітини — 1n2c. Анафаза IIНитки веретена поділу відтягують сестринські хроматиди до полюсів. Хроматиди стають самостійними хромосомами. Дочірні хромосоми прямують до полюсів клітини. Хромосомний набір кожного полюса — 1n1c (у клітині — 2n2c). Телофаза IIФормуються ядра. Ділиться цитоплазма. Утворюються чотири гаплоїдні клітини — 1n1c. Хромосомні набори клітин, що утворилися, не є ідентичними.

Значення мейозу. Клітини, що утворилися у результаті мейозу, відрізняються своїми хромосомними наборами, що забезпечує різноманітність живих організмів. Число хромосом при мейозі зменшується вдвічі, що необхідно при статевому розмноженні. Процес запліднення знову відновлює у зиготі диплоїдний набір хромосом.

Рекомбінація ДНК — це перерозподіл генетичної інформації ДНК, що приводить до виникнення нових комбінацій генів. Під час рекомбінації ланцюжок ДНК розривається, потім його фрагменти об'єднуються в іншому порядку. Гомологічна рекомбінація — це процес обміну нуклеотидними послідовностями між гомологічними хромосомами чи ланцюгами ДНК. Цей тип рекомбінації використовується клітинами для виправлення пошкоджень ДНК, створення нових комбінацій генів під час мейозу, тощо. Прикладом гомологічної рекомбінації ДНК є кросинговер. Негомологічна рекомбінація — це процес обміну нуклеотидними послідовностями між негомологічними хромосомами або ланцюгами ДНК. Прикладом такої рекомбінації є випадкове вбудовування вірусних чи бактеріальних фрагментів ДНК у ДНК клітини — хазяїна.

ПІДГОТОВКА ДО НМТ 2024

ДЯКУЮ ЗА УВАГУ !!!