Залежність швидкості ферментативної реакції від різних чинників

Залежність швидкості ферментативної реакції від різних чинників

Будь-які ферменти мають різну активність в залежності від температури, рН середовища, співвідношення кількостей реагуючих речовин тощо. Саме при виконанні наступних лабораторних робіт учні мають з’ясувати, як залежить швидкість ферментативної реакції від різних чинників.

Лабораторна робота №1

Залежність швидкості ферментативної реакції від температури

Мета: дослідити залежність швидкості ферментативної реакції від температури, перевірити вміння добирати необхідні реактиви та обладнання.

Реактиви: 1) індикатор бромтимоловий синій, 2) насичені розчини ацетилхолінхлориду, ацетилсаліцилової кислоти та бутилацетату, 3) 1% розчин крохмалю, 4) розчин Люголя (100 мл розчину містять: йоду – 1,0 г, калію йодиду – 2,0 г, гліцерину – 94,0 г), 5) фосфатний буфер рН = 8.

Матеріал дослідження: слина, розведена 1:10, екстракти з мікробних культур або насіння, екстракт печінки курки домашньої.

Дослід № 1. Залежність активності амілази від температури

Принцип

Крохмаль при розщепленні ферментами перетворюється на полімери з меншим ступенем полімеризації, далі – в мальтозу, потім – в глюкозу. Таким чином утворюється цілий набір сахаридів:

(C₆H₁₀O₅)_X→ (C₆H₁₀O₅)_Y→ (C₆H₁₀O₅)_Z→C₁₂H₂₂O_11→C₆H₁₂O₆

крохмаль    розчинний      декстрини     мальтоза     глюкоза, де x>y>z.

                     крохмаль

Декстрини, які утворюються при гідролізі крохмалю, також реагують з йодом, але колір комплексу залежить від ступеню полімеризації (див.таблицю 1).

Таблиця 1. Кольорові реакції декстринів з йодом

Низькомолекулярні декстрини проявляють ознаки альдегідної форми глюкози, тому що по мірі зменшення полімерного ланцюга росте частка залишків глюкози. Нерозщеплений крохмаль утворює з йодом комплекс фіолетового забарвлення.

Проведення аналізу

У чотири пробірки вносять по 10 крапель крохмалю, у інші 4 – по 10 крапель розчину амілази. Пробірки розділяють по парам 1-5, 2-6, 3-7, 4-8 і розміщують при різних умовах – першу пару поміщають у баню з льодом (0°С); другу залишають при кімнатній температурі (20°С); третю поміщають у водяну баню при t = 38-40°С; четверту – в киплячу водяну баню (100°С). Через 10 хв вміст кожної пари пробірок об’єднують, перемішують і інкубують ще на 10 хв при тих же умовах. По закінченню інкубування з третьої пробірки відбирають три краплини суміші на предметне скло і додають 1 краплю реактива Люголя. Якщо з’являється червоне або жовте забарвлення, то це вказує на завершення гідролізу крохмалю амілазою. Для виявлення результату аналіза в кожну пробірку додають 2 краплі реактиву Люголя і спостерігають за появою забарвлення, за яким роблять висновок про швидкість ферментативної реакції